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PCR


Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응

1984년 리 멀러스가 개발한 유전자 복제 방식으로, 이 방식으로 인해 원하는 유전자를 마구 증폭시킬수 있어서 유전공학의 발전을 가져왔다.


PCR의 세 단계를 나타내는 그림. 각 단계는 변성(Denaturation), 결합(Annealing), 신장(Elongation) 단계라고 한다. 변성 단계에서는 두 가닥의 DNA를 분리하고, 결합 단계에서 프라이머가 이 DNA에 결합한다. 그림에서는 온도가 55도라고 나오지만 반드시 55도인 것은 아니고, 프라이머의 길이에 따라 그 온도가 다르다.[1] [2] 또한 신장 단계에서는 다시 온도가 올라가면서 활성을 얻은 taq polymerase가 DNA를 합성한다. 합성 단계에서 걸리는 시간은 자기가 증폭하고자 하는 DNA의 길이에 따라 다른데, taq polymerase는 1분에 1000개의 뉴클레오티드를 합성한다. 그리고 케리 멀러스는 이걸 LSD를 빨고 일어난 환각에서 보고 개발해냈고, 이걸로 노벨상을 수상했다(여자친구와 차를 타고 가다가 아이디어를 얻었다는 설도 있다.).LSD에게 노벨상을!


PCR은 다른 기술과 동일하게 시간이 지날수록 가격이 떨어졌으며, 덤으로 효용도도 올라가 DNA를 만지는 곳에서는 PCR 장치를 다 구비하고 있다고 해도 과언이 아니다. 또한 어떤 양덕은 집에서 손쉽게 만들수 있는 PCR기계를 개발하기도 하였다.

간단히 말해, DNA 복제하느라고 제한효소 등 온갖 효소들과 복제를 해줄 세포등 온갖 재료를 쓰지 않고, 최소한의 효소 사용으로 복제하자는, 즉 고온에 DNA를 들이 박아서 DNA를 분리/복제하자는 발상이다. 세포들에 온갖 효소들이 존재하는 이유는 효소들이 행하는 작업을 효소 없이 하려면 웬만한 단백질은 변성되고도 남을 고온이 필요하기 때문인데[3], PCR은 역발상으로, 그냥 고온에 때려박아버린 것이다. 역시 약 빨고 만든 것 다운 발상이다. 이로써 작업에 필요한 효소는 복제 자체에만 관여하는 효소 하나만 챙기면 되므로 과정이 훨씬 단순해진다. 하지만, 초창기에는, 열에 약한 효소를 고온에 때려박는 다는 무식한 발상 답게 문제점이 많아 비용이 무지막지하게 비쌌다. 하지만 극한효소가 나오면서 정말 무식하게 복제가 가능해젔다. 대략적인 인간 DNA 분석에 단돈 15만원이면 충분하다.

PCR이 가격이 싸진 중요한 계기는 한 극한효소의 발견이 정말 컸다.[4] PCR은 고온에 DNA를 때려박아놓음으로써 작업에 필요한 온갖 촉매들을 배제한 것은 좋았는데, 정작 복제에 필요한 중합효소가 버티지를 못해서 불완전했다. 처음엔 PCR을 할때 E.Coli의 중합효소를 사용했는데 PCR을 하기위해서 DNA의 이중나선을 풀어야 하므로 고온의 환경에서 진행되는데 이때 일반적인 DNA중합효소는 이상태에서 비활성화 되기 일쑤였다.[5] 따라서 한번 PCR 1 cycle 돌릴때마다 효소가 비활성화돼서 새로 써야 되며 한번만 온도 잘못조절해도 처음부터 다시 돌려야 될정도로 까다로웠으므로 PCR 한번하는것이 굉장히 비쌌다. 그런데 Thermus aquaticus[6] 에서 발견된 Taq Polymarase는 고온에서도 안정하므로 PCR 여러번해도 활성을 유지하여 이런 번거로움과 비효율을 한번에 깨트리게 되었다. 정말 이 효소 덕분에 PCR를 획기적으로 수행할 수 있게 되었다.[7][8]

PCR의 종류는 상당히 많아서, 배지에서 키운 세균의 콜로니를 증폭시킬 DNA로 하는 colony PCR, RNA를 역전사한 후 cDNA[9]로 만들어서, cDNA를 증폭시켜 실험체 내에서 해당 유전자가 얼마나 발현중인지를 알 수 있는[10] 역전사 PCR(Reverse Transcriptase PCR), 원래 DNA나 RNA의 양을 실시간으로 측정하는 Real time PCR[11] 등, 가짓수도 활용법도 무궁무진하다. 가장 대표적인 예는 과학 수사나 친자 감별등에서 자주 이용하는 DNA 지문 분석.

여담으로 시중에서 판매되는 PCR기계는 굉장히 비싸다. 쓸만한게 천만원부터 시작한다. PCR은 딱 한번 하는게 아니라 실제로 쓸만한 DNA를 얻으려면 30번정도 반복해야되며 온도가 굉장히 중요한 요소이므로 빠른 가열과 감열, 그리고 잘 짜진 프로그램이 들어가야 제대로 되기 때문이다. 근데 저 위에보면 그렇지도 않은것 같은데 바가진가?[12]
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  • [1] Tm=2(A+T)+4(C+G)로 계산한다.
  • [2] A-T 결합이 수소 결합 2개인데 비해, C-G 결합은 수소 결합을 3개나 가지고 있어 결합을 끊기 위해 필요한 에너지가 많이 든다.
  • [3] 모든 화학반응은 고온에서 속도가 빨라지는 것은 상식이다. 또 기본적으로 화학반응은 그 반응에 참가하는 각각의 분자가 '문턱 에너지'를 넘어야 가능한데, 그 문턱 에너지를 넘었냐 안 넘었냐의 지표가 바로 온도.
  • [4] RT-PCR.
  • [5] 효소의 주성분은 단백질임을 상기하자. 웬만한 효소는 후라이팬 위의 계란후라이처럼 익어 버려서 더 이상 효소로써의 역할을 하지 못한다.
  • [6] 온천에 사는 원핵생물
  • [7] 그렇긴 해도 '연구실 수준'에서 싸진거지 보통사람이 보면 아직도 비싸 보일것이다. PCR에 필요한게 중합효소 뿐만아니라 Primer나 완충용액 등 이 필요한데 Primer 가격이 2~수십만원 정도로 비싼수준이다.
  • [8] 일반적으로 중합효소를 Taq을 쓰는데 Taq은 오류수정이 불가능해 오류율이 높으므로 높은 정확도가 필요하면 Pfu같은 효소를 섞어서 쓰기도 한다. 하지만 pfu는 taq보다 같은 시간 안에 합성할 수 있는 뉴클레오티드의 수가 적다.
  • [9] RNA는 그냥 PCR, 정확히는 역전사만 할 경우 정확도가 떨어진다. 그래서 역전사 후 해당 DNA를 PCR 하는 경우가 많다.
  • [10] mRNA로 cDNA를 합성할 수 있으니까 많이 발현중이라면 당연히 그 유전자에 대한 mRNA가 많이 있을 것이고, cDNA가 많이 합성된다.
  • [11] 과거엔 역전사 PCR, real time PCR은 둘 다 줄여서 RT-PCR이라 불렀으나, 요즘은 real time PCR은 qRT-PCR로, 역전사 PCR을 RT-PCR로 표기하는 경우가 많다. 사실 정식 논문엔 대부분 어떤 것의 약자인지 지정해주니까 별로 상관 없겠지만.(...)
  • [12] 일반인 및 아마추어 과학자용 PCR 장비가 유통이 안되기 때문이다. 천만원 이상은 연구실용
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last modified 2014-09-04 20:14:15
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